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本试剂盒可直接快速地对小鼠组织（如鼠尾、鼠耳、鼠趾、肌肉等）样本进行PCR扩增，具有极强的样本兼容性。本试剂盒配备了强力的裂解缓冲液，可以快速裂解样品，释放基因组DNA。裂解液可以直接加入到PCR反应体系中，无需精提纯化，操作方便。此外，本试剂盒对样品投入量要求低，5mg小鼠组织或1～5mm鼠尾即可进行实验。本试剂盒可用于转基因鉴定、小鼠基因分型等。

本试剂盒提供的2×Mouse Direct PCR Mix为2倍浓度的热启动PCR反应液，包含了用于PCR扩增除模板和引物外的所有组分，大大简化操作过程，降低污染几率。

• Buffer ML为裂解缓冲液，包含了强力蛋白变性剂，请戴手套操作。
  
• Buffer MT为终止缓冲液，用以终止Buffer ML的裂解功能。
  
• 2×Mouse Direct PCR Mix：包含热启动Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、MgCl₂、反应缓冲液、PCR反应增强剂、优化剂、稳定剂和电泳指示染料等。

• 为了避免样本间交叉污染，每次取样后都需要将取样器材的刃口或与样本直接接触的部位浸入2%次氯酸钠溶液中，反复洗刷数次，然后用干净的纸巾擦干残余液体后再进行使用。为了试验方便，也可准备多个取样器材，在使用完后进行统一清洗，确保每一单独样本均使用的是无污染的取样器材。
  
• 建议使用新鲜的动物组织，若为长期冷冻组织，应尽量避免反复冻融，否则会导致模板的降解，影响PCR效率。
  
• 建议扩增片段长度1kb以内，以便扩增效率最佳。
  
• 在PCR结果分析时，不管是阳性结果或阴性结果，如果没有对照反应，都不能确定结果是否可靠。为了便于后续实验结果的分析，建议在进行PCR时，设置阳性和阴性PCR对照反应以便于排除假阳性或假阴性的干扰。

• 样品基因组DNA释放
  
  • 剪取5～10mg动物组织或1～5mm鼠尾，置于1.5mL离心管中；
    
  • 在上述离心管中加入90μL Buffer ML，轻轻涡旋使得样品完全被裂解液浸润，短暂离心；
    
  • 在恒温孵育仪中设置95℃孵育15min；
    
  • 加入10μL Buffer MT，轻弹混匀，终止裂解;
    
  • 选做步骤：12000rpm离心2min；
    
  • 将上清转移至新的离心管，4℃或-20℃保存或直接取上清用于后续PCR扩增。
  注：
  • 组织应尽量剪碎，以便裂解反应更顺利进行。
    
  • 5℃孵育，一般15min即可满足多数PCR需求。若需要的DNA量较大或样品较难裂解，可将时间延长至30min。组织块不需完全裂解，残余的部分在后续离心步骤中可被除去。
  
  
• PCR反应鉴定—PCR反应体系
  

  成分	用量	终浓度
  2×Mouse Direct PCR Mix	10μL	1×
  Forward Primer (10μM)	0.5μL	0.2～0.4μM
  Reverse Primer (10μM)	0.5μL	0.2～0.4μM
  裂解产物（DNA模板）	1μL	-
  ddH2O	至20μL	-

  注：各组分使用前应充分混匀。
  • 模板使用量：建议按1～10%总体系量取用模板，20μL体系建议采用1μL上清液作为模板；
    
  • 引物终浓度：0.2～0.4μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可在0.1～0.5μM范围内调整引物浓度；
    
  • 反应体系：推荐使用20μL，也可根据使用习惯调整体系体积大小；
    
  • 体系配制：配制好PCR反应体系，置于涡旋仪上涡旋混匀，瞬时离心将反应液集于管底。
  
  
• PCR反应鉴定—PCR反应条件
  

  步骤	温度	时间	循环数
  预变性	94℃	5min	1
  变性	94℃	10sec	35
  退火	60℃	20sec
  延伸	72℃	30sec/kb
  终延伸	72℃	5min	1

  注：
  • 退火温度：请参考引物的理论Tm值，退火温度可设置低于引物理论值2～5℃。
    
  • 延伸时间：请按30sec/kb设定。
    
  • 扩增循环数：35个循环已可以扩增足量产物。
    
  • 电泳上样：取3～5μL扩增产物上样即可。